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貝賽小科普|關于動物模型的那些事(三)

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貝賽小科普|關于動物模型的那些事(三)

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【摘要】:
基因工程動物疾病模型是指某些遺傳性狀通過基因工程手段而被人為改造的動物。以對動物改造的手段不同可分為三類:轉基因動物、基因敲除動物、基因替換動物。


什么是基因工程動物疾病模型?

     

      基因工程動物疾病模型是指某些遺傳性狀通過基因工程手段而被人為改造的動物。以對動物改造的手段不同可分為三類:轉基因動物、基因敲除動物、基因替換動物。

 

 

 基因工程動物疾病模型的分類

 

?? 轉基因動物模型

       動物模型是現代生命科學研究的重要工具,特別是基因工程小鼠和大鼠,在基因功能研究、人類生理病理機制研究及新藥研發中起著不可替代的作用。

 

◆定義    通過實驗手段將新的遺傳物質導入到動物胚胎細胞中,并能穩定遺傳下一代,由此獲得的動物稱為轉基因動物。

◆特點    由于轉基因動物模型是將目的基因隨機整合到動物基因組中,所以被轉入的目的基因能夠在全身細胞內得到表達,但該基因整合的位點存在隨機性。

 

?? 基因敲除(入)動物模型

       通過基因工程手段將已知基因去除,或用其他順序相近的基因取代,而獲得的工程化動物。通常針對一個結構已知但功能未知的基因,通過觀察基因敲除動物的情況,推測相關基因的功能。

<全身性基因敲除動物模型>

       又稱完全性基因敲除動物模型,是把相關基因全部敲除,使動物全身細胞均不表達該基因的動物模型。

<條件性基因敲除模型>

       是按照要求來敲除實驗動物的基因,使動物某一特定組織或某一特定時期不表達該基因的動物模型。

<定點基因敲入動物模型>

       將目的基因引進特定的位點,使動物原本的基因組發生改變,從而得到的基因敲入動物模型。

 

??  基因替換動物模型

       與某個生理現象相關的兩個基因中,一個基因的編碼區被另一個基因的編碼區取代的工程化動物模型。

<點突變動物模型>

      將動物基因組中某一指定基因上的單個堿基使用其它堿基替換,造成位點突變,導致動物原本的基因組發生改變,從而得到點突變動物模型。

<片段置換動物模型>

       將動物基因組中某一指定基因片段使用其它基因片段替換掉,導致動物原本的基因組發生改變,從而得到的片段置換動物模型。

 

 

不同基因工程動物模型的比較

 

 

 

 

 技術支持

 

?? 核心應用技術① —— PiggyBac轉座子系統

<Tips>操作簡單,可承載的基因片段大,無需包裝慢病毒

    PiggyBac(PB)轉座子來源于鱗翅目昆蟲,最初是在研究桿狀病毒(Baculovirus)侵襲粉紋夜蛾細胞系TN-368時首次發現并分離到的。在分類上屬于真核生物的第二類轉座子,是一個自主因子,長2 476 bp,有短的末端反向重復序列(ITR)和一個開放編碼框(ORF),ITR長13bp,ORF長2.1kb。PB轉座子主要采取“cut-paste”機制發生轉座。

       PB系統轉座效率高,宿主范圍廣,研究發現PB系統在哺乳動物及其細胞中也具有高效的轉座活性,故近年來,該系統被大量應用于轉基因動物的制備當中,已在動物基因組功能研究、基因轉移及誘導多能干細胞等領域得到了廣泛應用。

 

(圖片來源:@凍春卷 from簡書)

 

?? 核心應用技術② —— CRISPR/Cas9基因編輯技術

<Tips>周期短,但存在馬賽克現象和脫靶現象

      CRISPR 是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制,是最新出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。在這一系統中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成雙鏈RNA,此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。

       CRISPR/Cas9系統能夠對小鼠和大鼠基因組特定基因位點進行精確編輯, 目前已經成功應用于大小鼠基因的KO/KI模型制備,其原理也是對目的片段產生特異的切割后,修復過程中產生移碼突變或者是片段缺失,或者是在切開位置產生片段插入等現象。

 

 

 (圖片來源于網絡)

 

 

 

 CRISPR/cas9技術與其他基因修飾技術對比

 

 

 

?? 核心應用技術③ —— 顯微注射技術

       顯微注射是一種常用的轉基因技術,能將外源基因直接注射到受精卵原核內,對DNA片段大小無限制,無需載體,可獲無載體片段的轉入目的基因,操作簡單,周期短。利用顯微注射可以實現將目的基因整合到小鼠受精卵的基因組中,并穩定遺傳給后代。

       該技術目前廣泛應用于制作基因編輯動物、轉基因模型動物當中,并起到了不可泯滅的作用。

 

 

 

主要實驗流程

 

(以全身性基因敲除動物模型為例)

 

 

 

 

 

A:建立基因工程動物模型的優點有哪些?

Q:以小鼠為例,由于小鼠與人類在生理學方面比較相似,小鼠突變表型接近人類遺傳病的表型,且小鼠基因與人類基因的相似度可達99%;小鼠基因組序列和連鎖圖已經比較清晰,遺傳背景也相對穩定;并且小鼠的繁殖速度快,每窩產仔數多,方便對照實驗。

     通過建立基因工程動物模型,主要是通過阻止、改變或增加特定基因在動物體內的表達,從而來研究基因結構與功能、建立人類疾病動物模型,尤其是遺傳病模型、研究各種藥物的作用機制和藥效學。

 

(圖片來源于網絡)

 

  

部分基因工程動物模型列舉

 

◆ DBDB小鼠模型:(Lepr基因敲除小鼠)

        DBDB小鼠(C57BL/KsJ)小鼠是Leptin受體點突變導致leptin信號通路障礙,從而導致dbdb小鼠出現肥胖、胰島素抵抗、高血糖、脂肪肝等癥狀。是由C57BL/KsJ近親交配株常染色體隱性遺傳衍化而來,屬Ⅱ型糖尿病模型。動物在一個月時開始貪食及發胖,繼而產生高血糖、高血胰島素,胰高血糖素也升高。DBDB小鼠一般在10個月內死亡。糖尿病DBDB小鼠(C57BL/6Jdb/db)發生嚴重的糖尿病癥狀,類似C57BL/KsJ ob/ob小鼠,即早發的高胰島素血癥,體重下降和早死。

 

◆ ApoE小鼠模型:(ApoE基因敲除小鼠)

       ApoE基因敲除(ApoE-knockout,ApoE-/-,ApoE-deficient)小鼠是迄今為止作為高脂血癥(高血脂, hyperlipemia, hyperlipidemia)模型復制的最理想的小鼠,也是基因工程小鼠中使用最廣泛和研究比較深入的小鼠?;诓煌副荆ㄒ靶?,Wild type)敲除ApoE(lipoprotein E)得到不同的ApoE-/-小鼠。最常用的是基于C57BL小鼠作為母本進行的ApoE基因敲除。

 

◆ AD小鼠模型:(APP/PS1轉基因小鼠)

        APP/PS1小鼠(AD)雙轉基因的小鼠可表達突變的人類早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉樣前蛋白(APPswe)融合體,APP/PS1(AD)雙轉基因小鼠這兩個基因的表達都由小鼠朊病毒蛋白啟動子啟動。人類早老素基因的DeltaE9突變是該基因的第九個外顯子缺失產生的,此突變會導致早發性老年癡呆癥。

 

◆ NVSG小鼠模型:(rkdc基因exon 37&Il2rg基因exon3-4雙敲除小鼠)

         NVSG小鼠缺乏成熟的T、B、NK免疫細胞,補體活性降低,巨噬細胞對人源細胞吞噬作用弱,可高效地移植人造血干細胞(HSC)、外周血單核細胞(PBMC),患者來源的異種移植物(PDX)或成體干細胞和組織,是目前公認的免疫缺陷程度高,用于腫瘤、免疫、自身免疫性疾病、免疫治療疫苗、GvHD/移植、安全性評估等研究的優秀模型。

 

 

 

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